Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Bonjour à tous,

une petite trouvaille très très intéressante. J’adore ce type de bricolage, et suis convaincu que cela peut marcher.

A vos tournevis !

Yannick

http://www.jove.com/video/2909/low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated-light-electron-microscopy

Troisièmes journées de la haute pression, 8 et 9 Novembre 2011 (suite)

Bonjour à tous,

nous voila de retour de ces deux journées très enrichissantes (bravo aux organisateurs). Pour ma part, j’ai été très agréablement surpris par le système CLEM qui est fourni avec  l’HPM100. Il est même compatible avec une observation LM avec un objectif 63X à immersion (huile). Pas de probleme de distance de travail …

pour ceux qui le souhaitent, j’ai pris quelques videos de la démonstration réalisée le 9 novembre. Les fichiers sont assez lourds, mais je peux surement vous les faire parvenir. Alors n’hésitez pas …

Bonne semaine

Yannick

Subcompartment localization of the side chain xyloglucan-synthesizing enzymes within Golgi stacks of tobacco suspension-cultured cells.

Plant J. 2010 Dec;64(6):977-89. doi: 10.1111/j.1365-313X.2010.04388.x. Epub 2010 Nov 15.

Source

Laboratoire ‘Glycobiologie et Matrice Extracellulaire Végétale,’ UPRES EA 4358, Institut Fédératif de Recherche Multidisciplinaire sur les Peptides 23, Plate-forme de Recherche en Imagerie Cellulaire de Haute Normandie (PRIMACEN), IBiSA, Université de Rouen, 76821 Mont-Saint Aignan Cedex, France.

Abstract

Xyloglucan is the dominant hemicellulosic polysaccharide of the primary cell wall of dicotyledonous plants that plays a key role in plant development. It is well established that xyloglucan is assembled within Golgi stacks and transported in Golgi-derived vesicles to the cell wall. It is also known that the biosynthesis of xyloglucan requires the action of glycosyltransferases including α-1,6-xylosyltransferase, β-1,2-galactosyltransferase and α-1,2-fucosyltransferase activities responsible for the addition of xylose, galactose and fucose residues to the side chains. There is, however, a lack of knowledge on how these enzymes are distributed within subcompartments of Golgi stacks. We have undertaken a study aiming at mapping these glycosyltransferases within Golgi stacks using immunogold-electron microscopy. To this end, we generated transgenic lines of tobacco (Nicotiana tabacum) BY-2 suspension-cultured cells expressing either the α-1,6-xylosyltransferase, AtXT1, the β-1,2-galactosyltransferase, AtMUR3, or the α-1,2-fucosyltransferase AtFUT1 of Arabidopsis thaliana fused to green-fluorescent protein (GFP). Localization of the fusion proteins within the endomembrane system was assessed using confocal microscopy. Additionally, tobacco cells were high pressure-frozen/freeze-substituted and subjected to quantitative immunogold labelling using anti-GFP antibodies to determine the localization patterns of the enzymes within subtypes of Golgi cisternae. The data demonstrate that: (i) all fusion proteins, AtXT1-GFP, AtMUR3-GFP and AtFUT1-GFP are specifically targeted to the Golgi apparatus; and (ii) AtXT1-GFP is mainly located in the cis and medial cisternae, AtMUR3-GFP is predominantly associated with medial cisternae and AtFUT1-GFP mostly detected over trans cisternae suggesting that initiation of xyloglucan side chains occurs in early Golgi compartments in tobacco cells.

The Plant Journal © 2010 Blackwell Publishing Ltd. No claim to original US government works.

PMID:
21143678
[PubMed – indexed for MEDLINE]

Troisièmes journées de la haute pression, 8 et 9 Novembre 2011

Le service de Microscopie Electronique de l’IFR83, Université Pierre et Marie Curie,

et la Société Leica Microsystèmes France

Ont le plaisir de vous convier aux troisièmes journées de la haute pression, qui se dérouleront les Mardi 8 et Mercredi 9 Novembre 2011 sur le Campus de Jussieu.

Au cours de ces journées, vous pourrez suivre, des présentations scientifiques, une « table ronde HPF » qui à pour but de réunir et de connecter les utilisateurs afin de partager les expériences, les présentations des nouveautés dans le domaine et un atelier CLEM (Correlative Light Electron Microscopy) autour de l’instrument de congélation haute pression Leica EM HPM100.

Pour participer, et connaître le détail de ces deux jours, il vous suffit de nous faire parvenir vos coordonnées par mail retour avant le Vendredi 4 Novembre 2011.

Espérant vous compter parmi nous.

Programme3eJourneesHautePression

Cordialement

Les organisateurs

jean-pierre.lechaire@snv.jussieu.fr
florence.hauger@leica-microsystems.com

Ghislaine.Frebourg@snv.jussieu.fr
Gregoire.Mercier@leica-microsystems.com

3rd High Pressure Freezing Meeting – 13-15 July, UCL, London

Bonjour à tous,

la semaine dernière s’est tenu le 3eme congrès international sur la congélation HP. C’était très intéressant et enrichissant. Je tacherai de mettre plus d’info quand j’aurai un peu plus de temps, mais sachez qu’à mes yeux, il y a 2 nouveautés qui méritent d’être suivies de près:

– Leica lance la commercialisation du SPF : appareil mis au point par Jan Leunissen et qui permet de faire de la HPF à moindre coût. Une machine très intégrée qui pourra séduire notamment ceux qui font des prélèvements sur le terrain. Nous devrions accès prochainement à des video des démonstrations faites pendant le congrès. Un papier est déjà sorti sur cette technique, mais elle a continué à évoluer (cf article déjà mentionné)

– Kent McDonald et Ric Webb ont développé un protocole de cryo-substitution très rapide (3h !!!) sans AFS et pour un investissement matériel minime : un thermomètre, un agitateur et un bloc de métal ! Les résultats sont surprenants. Suivez ce lien pour l’article.

En lien aussi le PDF du programme (HPF latest programme)  pour que vous puissiez voir quels ont été les sujets abordés. N’hésitez pas à me contacter si vous avez des questions spécifiques.

Bon été (bon, je sais aujourd’hui ca ressemble plus à l’automne …)

Yannick

Acétate d’uranyle, cryosubstitution et phosphates

Bonjour,

Une question aux aficionados de l’ajout d’acétate d’uranyle lors de la cryosubstitution :

l’acétate d’uranyle « inclus » dans les cellules lors de cette étape peut-il encore précipiter avec le PBS utilisé lors d’un immunomarquage ultérieur ?

Pour un même échantillon, j’ai de grosses différences de contraste et de qualité de morphologie entre les grilles juste contrastées, celles non contrastées et celles contrastées après immunomarquage avec PBS. Donc je cherche à éliminer petit à petits mes hypothèses.

Merci pour vos informations.

Michaël

High Pressure Freezing on C.elegans

Bonjour,

Je vous soumet un petit problème que j’avais et que j’ai soumis à Yannick, il m’a fait justement remarquer de le poster ici pour la communauté c’est chose faite.

J’ai mis en gras mes observations et celle de yannick. Je donnerai la conclusion à la fin.

Je travaille sur un projet avec une équipe de marseille qui a comme modéle C.elegans, et j’ai des problèmes notamment au niveau du contraste de mes images que je trouve toujours super pale et peu définie.

Voici un exemple :

Donc j’ai essayé pas mal de protocoles différents et des cryoprotectants différents.

J’ai commencé par celui-là :

On a shooté avec différent cryoprotectants, apres plusieurs essai, je suis resté sur du sucrose à forte concentration.

Il s’avère que le sucrose ralenti et diminue l’effet de la substitution. J’avais pris ce cryoproctectant aussi car je visualiser bien mes vers, ce qui était un point important du type d’expérience que je faisais

AFS for 48 h at –90◦C in 2% osmium tetroxide, 0.25% uranyl

acetate, 0.5% glutaraldehyde

The temperature was raised to –30◦C at a rate of 3◦C/h followed by

a 24 h incubation at –30◦C in pure acetone and infiltrated with

graded concentrations of an epon resin mix (Sigma).

Il ressemble beaucoup au tiens sans l’eau et avec un temps à -90 °C plus court.

Pourtant j’obtiens quelques de vraiment très pale, que j’ai du mal à séparer de la résine même apres coloration au plomb et uranyle.

Ensuite j’ai essayé l’autre protocole que je connais bien

-90C for 4 days in 0.1% tannic acid, 0.5% gluteraldehyde in anhydrous acetone

-90C for 4 hours in anhydrous acetone, changing the acetone several times

-90C for 4 hours in 2% osmium in anhydrous acetone

-90C to –20C at 5C/hr, total of 14 hours

-20C for 16 hours

-20C to 4C at 6C/hr, total of 4 hours

4C for 4 hours

Dans le protocle initial, il laisse en plus 4 heures à 4°c mais jean paul avait peur que ça donne une poudre informe donc j’ai rincer une fois à 4°c mais ça reste super pale (photo que tu as)

Voilà on en est là, je pense pour ma part, que c’est l’action de l’osmium qui se fait pas ou peu et j’aurai tendance à laisser plus longtemps dans l’AFS à plus haute température pour que celui-ci fasse effet.

Yannick m’a donc donner deux indications, la première que le sucrose pouvait expliquer cet aspect pale de mes photos (cf 1 commentaire gras) et que je pouvais laisser plus longtemps mes échantillons dans le fixateur.

Jean-Paul se demande si ce n’est pas un problème de résine, en effet on a tous fait en Epon et on a jamais changé de résine.

Il m’a également conseiller d’essayer de faire des manipulations pour la morphologie mais en incluant dans la résine Lowycril, ce qui donne une meilleur conservation des membranes.

Au final, on a fait d’autre essais, on a choisis la BSA 20 %, mais il restait le problème que celle-ci était opaque. Yannick et Stéphanie nous on expliquai que ceci pouvait venir du dessicant que l’on ajouter à l’acétone pour enlever l’eau. Dans leur manipulations, la BSA ne devenait pas noir.

Nous sommes en train de refaire une expérience de confirmation avec de nouveaux protocoles de cryosubsitution notamment avec une inclusion en HM20.

Cours EMBO de microscopie électronique

Bonjour à tous,

comme chaque année, ce cours propose une approche assez large des techniques pour la ME cellulaire, avec notament une approche complète de la technique de Tokuyasu.

cours EMBO

Grilles pour microscopie corrélative

Bonjour à tous,

Si certains d’entre vous ont déjà observé de la fluorescence directement sur grilles, peuvent-ils me dire quels types de grilles ont été testées et les résultats obtenus.

Personnellement j’ai un bruit de fond assez important (grilles Ni formvar ou Au formvar)

Merci d’avance de vos retours d’experience

Benoit

IBS Grenoble

prep de plante a froid?

Bonjour,
quelqu’un pourrait il me donner des conseils sur les protocoles a utiliser pour cryofixer des racines et des feuilles de plante ?
Plus précisément, quel type de cryoprotectant utiliser, temps de substitution et mix a utiliser etc…
Merci d’avance !
stéphanie




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